28 `Seurat` (上) 质控与标准化：识别并剔除“假细胞”与“坏细胞”

28.1 【导语】万事之源：为何要这样做？

单细胞悬液的制备与微流控捕获过程，绝非百分之百完美。这一不完美性，会在我们的原始数据中，系统性地引入两类核心的“噪音数据”。第一类是“低质量或死亡细胞”：这些细胞的细胞膜在处理过程中已经破裂，导致其细胞质内的信使RNA（mRNA）大量逃逸。因此，它们在测序后表现为可检测到的基因数量（nFeature_RNA）极少，且由于线粒体相对完整，线粒体基因转录本的比例（percent.mt）会异常升高。

第二类噪音是“双细胞”（Doublets）或多细胞（Multiplets）：即两个或多个细胞被错误地包裹进了同一个油滴（GEM）中。这会人为地创造出一个“嵌合体细胞”，其表现为UMI总数（nCount_RNA）和基因总数异常偏高。在进行任何下游的生物学分析之前，我们必须通过一套严格的质控流程，如同机场的“安检”一般，将这些“假冒伪劣”的细胞数据从数据集中剔除出去。否则，它们将作为强烈的干扰源，严重扭曲后续的降维与聚类分析，最终导致错误的细胞分群结果。

28.2 【核心实践】从原理到决策

28.2.1 【第一步：创建Seurat对象与数据读取】

所有分析的起点，是将10x Genomics的标准输出文件夹读入R，并构建Seurat分析的核心数据结构——Seurat对象。

## 加载 10x Genomics 数据
pbmc.data <- 
  Read10X(
    data.dir = 
      "filtered_feature_bc_matrix/"
  )
## 并创建 Seurat 对象
pbmc <- 
  CreateSeuratObject(
    counts = pbmc.data,
    project = "pbmc3k",
    min.cells = 3,
    min.features = 200
  )

Read10X负责读取三个核心文件，而CreateSeuratObject则将这些信息整合，并进行一个初步的、非常宽松的过滤。

28.2.2 【质控的核心“三板斧”：基于三个指标的决策】

我们后续的精细化质控，主要依据三个核心的生物学指标来进行决策。

nFeature_RNA (每个细胞检测到的基因数)

这个指标直接反映了细胞转录本的复杂度和数据的捕获效率。一个过低的nFeature_RNA值，可能代表这个细胞已经破碎，大部分RNA已经降解或丢失。而一个异常过高的值，则强烈暗示这可能是一个“双细胞”。我们的决策，是通过绘制小提琴图（VlnPlot），观察整体数据的分布，并设定一个合理的上下限阈值，例如 nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 5000。

nCount_RNA (每个细胞的总UMI数)

这个指标与nFeature_RNA高度相关，是评估每个细胞文库大小的直接指标。它同样可以用来辅助识别双细胞（其UMI总数会异常高）。

percent.mt (线粒体基因转录本的比例)

后果驱动分析：当一个细胞进入凋亡或濒死状态时，其细胞质中的mRNA会迅速降解，但包裹在双层膜结构中的线粒体则相对稳定。这会导致，虽然总的RNA量下降，但来自线粒体基因的转录本，在剩余的总RNA中所占的比例会异常升高。因此，一个高比例的线粒体基因读数，是细胞“健康状况不佳”的一个强烈分子信号。我们的决策，是通常设定一个经验性的阈值（例如 < 5% 或 < 10%），来过滤掉这些濒临死亡的细胞。

28.2.3 【第二步：标准化与高变基因识别】

标准化 (NormalizeData)

与Bulk RNA-seq类似，单细胞数据也必须进行标准化，以消除细胞间因测序深度不同而引入的技术偏差。Seurat默认采用一种名为LogNormalize的方法。其逻辑是，先将每个细胞中每个基因的UMI count除以该细胞的总UMI count，再乘以一个比例因子（默认为10000），最后对结果加1后取自然对数。

识别高变基因 (FindVariableFeatures)

这是后续所有降维分析得以成功的、一个至关重要的“降噪”决策。在一个细胞中，数万个基因并非都包含用于区分细胞类型的信息。大量的“管家基因”在所有细胞中的表达水平都相对恒定。FindVariableFeatures的作用，就是通过统计模型，找出那些在不同细胞间表现出远高于预期的、高度变异的基因（通常选择前2000个）。我们的决策是，在后续的降维分析中，只使用这些“高变基因”，因为它们最有可能携带了定义细胞身份与状态的“真实生物学信号”。

28.3 【认知升维】常见的思维陷阱与对策

28.3.1 思维陷阱一：套用固定的质控阈值

新手最常犯的错误，就是从网络教程或文献中，直接复制一套固定的质控阈值（例如 nFeature_RNA < 2500, percent.mt < 5），并将其不加思索地应用于自己的数据集。

其对策是，必须在认知中建立一条铁律：单细胞的质控阈值设定，必须是“数据驱动”的。你必须先通过VlnPlot或FeatureScatter等可视化工具，仔细观察你自己数据的实际分布情况。一个好的阈值，通常设定在数据分布的“拐点”或明显与主体部分离的“离群点”区域。你设定的每一个数字，都应该能够基于你数据的分布图，给出一个合理的解释。

28.3.2 思维陷阱二：忽视批次效应

当分析的数据来自于不同的实验批次、不同的供体或不同的处理条件时，新手常常会直接将它们合并在一起进行分析。这是一个极其危险的操作，因为不同批次间固有的技术差异（即“批次效应”），其信号强度往往会远大于真实的生物学差异，导致在降维图上，细胞首先按照批次分开，而不是按照细胞类型分开。

其对策是，必须了解并使用Seurat v4及以后版本提供的、基于SCTransform和Integration的标准化与数据整合流程。这套流程是当前解决单细胞数据批次效应的“黄金标准”，也是进行任何多样本、多条件单细胞比较分析时，一个不可或缺的关键步骤。

28.4 【总结与拓展】构建你的思维框架

我们必须将单细胞数据的质控与标准化过程，视为一次极其严格的“宇航员筛选”工程。在这个思维框架中，你的核心任务，是首先通过一系列严苛的生理指标测试（nFeature_RNA, nCount_RNA, percent.mt），淘汰掉所有“身体状况不合格”的候选者（死细胞、双细胞）。然后，再通过一轮高难度的“专业能力与潜力测试”（高变基因识别），从合格者中，选拔出那些最能代表团队多样性与核心能力的“精英宇-航员”。只有这样一支精挑细选的队伍，才能为后续成功的“太空探索”任务（降维、聚类与生物学发现）奠定坚实的基础。

基于此框架，请思考一个能够挑战常规思维的启发性问题：在分析来自某些特定组织（例如，心肌或骨骼肌）的单细胞数据时，你可能会发现，几乎所有细胞的线粒体基因比例，都普遍地、系统性地偏高。在这种情况下，你认为这还一定代表细胞质量差吗？或者，这背后是否存在其他更合理的生物学解释？面对这种情况，你会如何调整你的质控策略，而不是简单地套用一个固定的percent.mt < 10%的阈值？

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