11  BAM 文件初探：用 samtools 对比对结果进行排序、索引与“侦察”

11.1 【导语】万事之源：为何要这样做？

序列比对软件输出的 BAM 文件，本质上是一个庞大却未整理的信息集合。它记录了数以亿计的测序 Reads 在参考基因组上的潜在位置，但记录顺序是按照 Reads 处理的先后，而非基因组的物理坐标。

这就好比拥有了一座藏书亿万的巨型图书馆，但所有图书都随意堆放在地上，没有经过任何分类或编目。在这种混乱状态下，任何依赖“基因组位置”的下游分析——例如查看某个基因区域的覆盖情况，或统计特定染色体区间的变异——都会变成一场计算灾难。

samtools 的使命，就是终结这种混乱。它并不是一个复杂的分析工具，而是一个“数据结构工程师”。它的任务是：

  1. 强制排序——把 BAM 文件按照基因组坐标整理，就像为图书馆重新上架。

  2. 建立索引——为 BAM 文件创建快速检索目录，使任何下游工具都能迅速定位目标区域。

通过这两个步骤，原始、低效的数据堆被转化为一个结构化、可高效查询的科学资产。

11.2 【核心实践】从原理到决策

11.2.1 samtools flagstat：整体质量诊断

samtools flagstat 为 BAM 文件生成一个整体质量报告：

samtools flagstat sorted_aln.bam

重点关注的指标是：

  • mapped (… : …) 这一行，显示总体比对率。
  • 在高质量的全基因组或转录组测序中，比对率通常应在 80%–95% 以上。
  • 如果比对率过低，常见原因包括：样本污染、参考基因组版本错误、或接头序列未清理干净。

11.2.2 samtools idxstats：分染色体比对统计

samtools idxstats 则利用索引文件，快速汇总每条染色体上的比对情况：

samtools idxstats sorted_aln.bam

示例输出：

chr1    248956422   3500000   1200
chr2    242193529   2900000   1100
chrM    16569       80000     300
*       0           0         50000

字段含义：

  • 第一列：染色体/contig 名称

  • 第二列：参考序列长度

  • 第三列：比对到该染色体的 reads 数

  • 第四列：未比对（unmapped）的 reads 数

诊断意义：

  • 若某条染色体的 reads 数异常低 → 可能提示覆盖不足或数据丢失。
  • 若非目标染色体或意外 contig 上出现大量 reads → 可能提示样本污染。
  • * 一行记录所有完全未比对的 reads。

11.2.3 flagstat + idxstats：组合排查思路

这两个工具往往配合使用：

  1. 先看 flagstat → 把握总体情况

    • 判断比对率是否合理（通常 80%–95%）。
    • 如果比对率过低 → 检查接头清理、参考基因组版本，或怀疑样本污染。

  2. 再看 idxstats → 定位具体问题

    • 大量 reads 集中在 chrM → 可能是文库偏好或 mtDNA 污染。
    • 各染色体分布均匀但总体偏低 → 可能是测序深度不足。
    • 大量 reads 落在非目标物种 contig 上 → 可能是交叉污染。

这种组合使用方式，就像医生先做一次“体检总览”（flagstat），再进行“分部位检查”（idxstats），帮助研究者快速定位潜在问题。

11.3 【认知升维】常见的思维陷阱与对策

11.3.1 思维陷阱一：比对后忘记排序和索引

这是新手最常犯的、必然导致下游流程失败的错误。他们直接将比对软件输出的原始BAM文件，用于后续的定量或变异检测，结果只会得到下游工具无情地报错：“BAM not sorted” 或 “Cannot find index”。

其对策是，必须在思维和实践中，将“比对 -> 排序 -> 索引”这三个步骤，固化为一个不可分割的、连续的原子操作流程。在任何分析脚本中，samtools sort和samtools index都必须紧跟在比对命令之后，这应成为一种标准化的肌肉记忆。

11.3.2 思维陷阱二：BAM与BAI文件的人为分离

用户在整理文件时，可能会移动或重命名aln.sorted.bam文件，但却忘记了对aln.sorted.bam.bai这个“影子文件”进行同样的操作。这会导致所有依赖索引的程序无法找到它，从而失效。

其对策是建立一个心智模型：已索引的BAM文件和它的BAI文件，是生命共同体，二者必须永远待在同一个目录下，且主文件名必须完全一致。移动或重命名时，必须对它们进行同步操作。

11.4 【总结与拓展】构建你的思维框架

我们必须构建一个关于BAM文件的正确思维框架：一个原始的比对输出，仅仅是“潜在的信息”；而一个经过samtools排序和索引的BAM文件，才是一个真正“可被查询的数据库”。samtools的核心工作流，本质上就是将前者转化为后者的、一个必不可少的“数据结构化”过程。它是连接原始比对产出与下游生物学问题解读之间，最坚实、最基础的桥梁。

基于此框架，请思考一个更进一步的启发性问题：现在，你拿到了一个来自合作实验室的BAM文件。运行 samtools flagstat 后，你发现总体比对率只有 40%，远低于预期的 90%。同时，samtools idxstats 显示，超过一半的比对reads都集中在一条名为 ‘contig_human_herpesvirus_4’ 的序列上。基于本文讨论的排查思路，你将如何向合作者描述这个问题？你会建议他们从哪几个方面着手，去追溯这个问题的根源？

探索生命科学前沿，提升实战技能！欢迎微信搜索并加入「生信实战圈」，获取最新技术干货、实战案例与行业动态。 点击关注，与同行一起成长！